Comparaison de deux techniques d’extraction d’ADN de Plasmodium à partir de gouttes épaisses Comparison of two Plasmodium DNA extraction methods from thick blood films

Contexte. L’analyse de l’ADN est capitale en biologie moléculaire. Le diagnostic du paludisme, la détection de la résistance aux antipaludiques et les essais de vaccin recourent parfois à l’ADN plasmodial par PCR. L’ADN est généralement extrait du sang total ou de liquide fixé sur le papier filtre. Cette étude évalue deux méthodes d’extraction différentes: avec les 16® LEV Maxwell (Promega Corporation, Wisconsin, USA) et avec le QIAAMP® (Qiagen GmbH, Hilden, Allemagne) à partir de sang séché et coloré sur des lames de gouttes épaisses.
Méthodes. Des gouttes épaisses ont été confectionnées à partir d’un échantillon de sang contenant le Plasmodium ovale (parasitémie 1240 parasites / pl), en utilisant entre 15 pi de sang par Goutte épaisse. Après grattage des lames, le matériel a été transféré dans un microtube
contenant 100 pi de PBS. Le mélange ainsi obtenu a servi d’échantillon pour extraction par un kit Maxwell® 16 (avec LEV kit ADN de sang et LEV simplement ARN kit de cellules) et par QIAAMP. Un spectrophotomètre (Nanodrop®) a permis la quantification de l’ADN et l’amplification obtenue par PCR en temps réel (RT-PCR). Les quantités obtenues, ainsi que les CT ont été comparés pour les deux méthodes.
Résultats. L’ADN plasmodial a été correctement quantifié par les deux techniques ADN Plasmodium a été correctement extrait et quantifié comme par (Maxwell® et Qiagen). L’extraction par le Maxwell® a néanmoins fourni plus d’ADN que celle par Qiagen (12,56 ng vs 3,74 ng) lorsque la méthode utilisait le LEV kit d’ADN du sang, mais des quantités d’ADN inférieures en cas d’usage du LEV ARN simple kit des cellules (1,99 ng
vs 3,74 ng). La plus faible valeur Ct a été obtenue lors de l’utilisation exclusive du LEV ARN kit de cellules de Maxwell®. L’usage isolé du LEV pour le DNA sur sang total n’a donné aucun signal en RT-PCR.
Conclusion. Les deux méthodes décrites sont efficaces pour l’extraction de l’ADN, avec toutefois de plus faibles quantités de sang pour les gouttes épaisses par rapport au sang total (50 pi vs 200 pi). Le rendement de la technique Maxwell semble cependant supérieur, vue l’extraction automatisée, et la rapidité. La goutte épaisse est donc une source fiable pour l’ADN Plasmodial, surtout dans des conditions de précarité où le transport et
la manipulation des échantillons sont laborieux.

Mots-clés: extraction de l’ADN, Plasmodium, PCR en temps réel

Background. Getting DNA became capital since the emergence of molecular assays. Plasmodium DNA is used for malaria diagnosis by PCR, monitoring of molecular resistance or for clinical vaccine trial. DNA is commonly extracted from liquid whole blood or fixed on filter paper. In our study, we investigated two different extraction methods: with the Maxwell® 16 LEV (Promega Corporation, Wisconsin, USA) and with the QiAamp® (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) from blood dried and stained on slides known as thick blood
films (TBF).
Methods. We made a series of TBFs from a blood sample containing Plasmodium ovale (parasitaemia: 1240 parasites/μl), using among 15μl of blood per TBF. We scratched out the TBF and transferred the material to a microcentrifuge tube containing 100 μl of PBS. We used that mixture as sample for our extraction by Maxwell®16 (with LEV blood DNA kit and LEV simply RNA cells kit) and by QiAamp. We quantified the extracted DNA with a spectrophotometer (Nanodrop®) and amplified it by Real-time PCR (RT-PCR). We compared quantity and Ct values for both methods.
Results. Plasmodium DNA has been correctly extracted and quantified as well as by Maxwell® than by Qiagen. Extraction with the Maxwell® gave more DNA than Qiagen (12.56 ng VS 3.74 ng) if using LEV blood DNA kit but lower DNA amounts (a less quantity)
when using LEV simply RNA cells kit (1,99ng VS 3,74ng). The lowest Ct value has been obtained when using LEV simply RNA cells kit of Maxwell®. Only LEV blood DNA has not given any signal in RT-PCR.

Conclusion. Both methods described in our studyachieve the extraction of DNA. However, extraction from TBFs uses lower amounts of blood (50μl) than the extraction from whole blood (200μl). Maxwell seems to be better than Qiagen because extraction is automated
and faster with a higher yield. We conclude that TBFs are a reliable source for Plasmodium DNA in low income countries where sample transport and preservation are difficult.
Keywords: DNA extraction, Plasmodium, real-time PCR.